MiSeq System: A plataforma Illumina MiSeq possibilita o sequenciamento em paralelo de moléculas de DNA com alta qualidade de dados, permitindo a montagem de pequenos genomas, metagenômica, criação de perfis de expressão de genes alvos ou a detecção de variantes com acurácia, mesmo em regiões de homopolímeros. O multiplexing (indexação) de amostras permite redução no tempo de preparo e nos custos de sequenciamento por amostra. Capacidade máxima de sequenciamento: 15 Gb e 25 M single-reads (50M paired-end reads), em configurações de reads de 1×36 pb a até 2×300 pb conforme o kit de sequenciamento.

• Importante: a compra de todos os reagentes (incluindo os reagentes de sequenciamento e de preparo de bibliotecas) deverá ser realizada pelo próprio usuário.
• Observação: a Illumina não recomenda o uso de reagentes vencidos, e não podemos garantir o desempenho das execuções quando são utilizados reagentes fora do prazo de validade, uma vez que isso pode comprometer a qualidade dos resultados. A degradação dos reagentes pode interferir na incorporação correta das bases, o que pode levar à perda de sinal dos clusters gerados e, eventualmente, causar a falha da corrida. Além disso, reagentes vencidos podem conter precipitados que não são visíveis a olho nu, mas que podem obstruir o sistema de fluidos do instrumento, danificando-o. Em caso de dúvidas, entre em contato pelo e-mail sequenciamento.ms@fiocruz.br.
• Kit a ser utilizado: se tiver dúvidas sobre qual kit utilizar, é possível acessar o “Library Prep Kit Selector” (https://www.illumina.com/library-prep-array-kit-selector.html) para planejar o experimento. O sucesso de uma corrida depende de muitos fatores, desta forma, também aconselhamos que você acesse o website sobre o MiSeq e a tecnologia Illumina (https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html). 
• Agendamento e entrega do pool de bibliotecas e dos reagentes para sequenciamento: O agendamento deverá ser solicitado inicialmente por e-mail (sequenciamento.ms@fiocruz.br). Após o contato, será disponibilizado um formulário para efetivar o agendamento. A data será definida conforme a ordem de recebimento dos formulários e das Sample Sheets corretamente preenchidas, incluindo a informação da concentração real do pool de bibliotecas. Não serão aceitas ‘pré-reservas’, pois o cancelamento de corridas decorrente de atraso ou problemas no preparo de bibliotecas interfere na programação do LABSEQ-FIOMS. Ao submeter as amostras o usuário deve fornecer a média do tamanho dos fragmentos e a concentração em ng/uL (feito pelo Qubit ou através de um ensaio fluorimétrico equivalente – não utilizar o Nanodrop). É de responsabilidade do usuário fornecer informações confiáveis. O LABSEQ-FIOMS utiliza um controle interno para assegurar a qualidade das corridas (PhiX Control). A entrega do pool deverá ocorrer juntamente com a entrega dos reagentes para sequenciamento e um HD para cópia física dos dados. As bibliotecas já deverão estar misturadas (no caso de múltiplas amostras) e normalizadas na concentração indicada pelo usuário no formulário em volume mínimo de 20μL. No momento da entrega do pool e dos reagentes para sequenciamento, teremos o Ponto de Checagem: será medida a concentração do pool em Qubit e o usuário deverá concordar em prosseguir com o sequenciamento assinando o formulário. Nossa equipe fará a diluição final e a desnaturação. Na ocasião da entrega, será fornecida a previsão para a entrega dos dados.
• Entrega dos dados e análise: A produção de dados pelo MiSeq varia conforme a utilização dos kits de sequenciamento e o sucesso da clusterização, variando de 1 a 25 milhões de reads (1 a 15  gigabytes de dados). Não é assegurado número mínimo de reads na corrida de sequenciamento. O preparo de bibliotecas, o tipo de amostra, a forma de quantificação, entre outros fatores, podem afetar os resultados. Desta forma não é realizada a reposição de cartucho em caso de insatisfação com os resultados. Os dados são entregues no formato FastQ via e-mail (sequenciamento.ms@fiocruz.br). Além disso, o usuário pode criar uma conta no Illumina Basespace (https://basespace.illumina.com/home/index) e realizar análises na nuvem. No caso do MiSeq é feita transferência de dados para a nuvem na conta do usuário do Illumina Basespace, onde o usuário terá acesso aos arquivos FastQ. O LABSEQ-FIOMS não se responsabiliza por eventuais problemas de upload/download e uso da nuvem Illumina-BaseSpace. Arquivos FastQ podem, ainda, ser importados para a nuvem BaseSpace utilizando um guia rápido (http://blog.basespace.illumina.com/2014/08/18/fastq-upload-in-now-available-in-basespace/). A análise dos dados gerados será de responsabilidade do usuário.

• Resumo do fluxo de trabalho:
  1. Verificar a compatibilidade dos INDEXs;
  2. Preparar a biblioteca de DNA/RNA usando métodos compatíveis com a plataforma Illumina MiSeq;
  3. Efetuar o controle de qualidade das amostras (Qubit/TapeStation/Real-Time PCR);
  4. Entrar em contato por e-mail (sequenciamento.ms@fiocruz.br)
  5. Preencher o formulário (que será disponibilizado) e enviar juntamente com a Sample Sheet para o e-mail sequenciamento.ms@fiocruz.br. Os agendamentos serão realizados somente para amostras prontas. Não serão aceitas ‘pré-reservas’;
  6. Entregar as amostras e o kit de sequenciamento no LABSEQ-FIOMS  (Laboratório de Biologia Molecular - C002, Bloco L da Universidade Católica Dom Bosco (UCDB)), de segunda à quinta-feira, de 9h até 17h. Na sexta-feira, de 9h até 12h. O não comparecimento sem aviso prévio de 24 horas poderá implicar na suspensão do usuário.